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泛素化介導花瓣衰老機制研究

 

合作老師:華南農業大學  余義勛
發表期刊:《Plant Physiology》     IF:6.28

文章下載鏈接:http://www.rrkjl.com.cn/uploads/tmp/genedenovo-resume-1492570663.8373396.pdf

植物花瓣生命周期短,因此是衰老研究的重要材料。衰老(凋謝)是一個非常復雜的過程,它在mRNA、蛋白以及翻譯后修飾等多個水平受到調控,其中蛋白質大量降解是衰老的重要標記。泛素化修飾是一種重要的蛋白質翻譯后修飾,它能夠促進蛋白質降解,因此泛素化被認為與衰老有關。

另一方面,已有研究表明,乙烯能夠通過調節轉錄后修飾介導的蛋白降解參與到花瓣凋謝當中,但其機制還不明確。因此,本研究以矮牽牛花瓣為材料,通過轉錄組、蛋白組和蛋白質泛素化修飾組學分析,研究乙烯對花瓣衰老過程的影響機制。


實驗取材
取16小時乙烯處理(實驗組)和空氣處理(對照組)各三個重復的花冠組織進行轉錄組測序、蛋白組以及泛素組質譜分析。

研究思路
文章主要通過蛋白組與泛素化組,輔助以轉錄組的方法開展研究(圖1)。


圖1 文章研究思路

結果解讀
1、乙烯加速花瓣凋謝
在乙烯處理后16h,矮牽牛花冠裂片開始內卷,并且伴有透明小點出現,表明花瓣開始凋謝(圖2A)。在處理后32h,無論是花冠干重(圖2B)還是蛋白含量(圖2C)都明顯降低。這些結果都表明乙烯加速了花瓣凋謝。


圖2 乙烯對花冠影響
(A:上面為乙烯處理組,下面為未處理對照組;B、C:藍色為對照組,紅色為處理組)

2、乙烯引起花瓣轉錄、蛋白和泛素化組改變
由于花瓣衰老在mRNA、蛋白以及翻譯后修飾三個層面都有密切關系,因此作者分別通過轉錄組、蛋白組以及泛素化組同時研究乙烯對花瓣衰老的影響:

①首先,在轉錄組層面,利用根莖葉花等八個組織構建參考基因組后,通過轉錄組測序分析發現16小時的乙烯處理引起花瓣的14448個基因表達下調,6303個基因表達上調。qRT-PCR驗證了其中的基因(圖3),KEGG注釋表明這些差異基因主要與植物激素信號轉導等22條通路相關。

②然后,在蛋白水平,通過質譜分析發現了個3606個蛋白,其中上調的有233個、下調為284個。GO注釋發現這些蛋白與雜環分解代謝過程等功能相關。

③最后,在翻譯后水平,也就是泛素化組(Ubiquitylome)進行研究。通過抗體富集以及質譜研究,精確地發現了2270個賴氨酸泛素化位點(Kub),其中乙烯處理后上調位點有320個,下調的則有127個。這些結果顯示乙烯處理增加了花冠泛素化水平。KEGG注釋表明這些正經歷泛素化的蛋白參與到剪接體、RNA轉運等多個通路當中(圖4)。


圖3 轉錄組與qRT-PCR檢測差異表達基因情況


圖4.具有差異Kub位點的蛋白功能注釋
(A:上調、B:下調)和KEGG注釋(C:上調、D:下調)

3、轉錄本數量與蛋白存在一定正相關性
以顯著差異上、下調轉錄本為對象,對比對應的蛋白表達數據發現,上調轉錄本與對應蛋白存在一定相關性(r =0.49),而下調轉錄本則基本與蛋白數量難以產生聯系(r=0.08)。同理,以顯著上、下調蛋白為對象,對比對應轉錄本也發現上調部分有較高正相關(r=0.53),下調部分相關性較弱(r=0.21)。這可以預期到翻譯后修飾有可能參與到蛋白調控當中,從而引起轉錄本與對應蛋白數量沒有完全正相關。


圖5 轉錄本與蛋白表達相關性
(A:所有差異轉錄本vs所有差異蛋白、B:上調轉錄本vs對應蛋白、C:下調轉錄本vs對應蛋白、D:上調蛋白vs對應轉錄本、E:下調蛋白vs對應轉錄本)

4、蛋白組與泛素化組存在負相關性
由于之前假設,乙烯處理能夠引起泛素化的上調,從而導致蛋白的大量降解,因此下一步則研究花冠的蛋白組與泛素組之間的關系。通過蛋白組與泛素化組的關聯分析,可以發現存在泛素化位點的蛋白共有1121個,其中985個正在經歷泛素化作用。通過對蛋白質總體表達水平和泛素化修飾蛋白數量進行比較,發現無論整體(圖4A)還是從上下調的蛋白(圖4 B、C)以及泛素化蛋白(圖4D、E)開始進行比較,蛋白組與泛素化組之間存在負相關性。表示泛素化與蛋白降解有關。


圖6 總蛋白表達與泛素化位點蛋白相關性
(A:所有差異轉錄本vs所有具有泛素化位點差異蛋白(r=-0.38);B:上調蛋白vs對應泛素化位點(r=-0.51);C:下調蛋白vs對應泛素化位點(r=-0.4);D:上調位點vs對應蛋白(r=-0.32);E:下調位點vs對應蛋白(r=-0.25);F:整體統計)

5、泛素化參與乙烯引起的蛋白降解
數據不單證明蛋白與泛素化位點成負相關,而且進一步發現,乙烯處理能夠促進參與泛素化的蛋白的表達,從而引起蛋白大量降解。在轉錄組數據中,發現229個與泛素化相關的unigene在乙烯處理后發生上調。而蛋白組數據則發現4個蛋白在處理后發生上調。同時,在發生泛素化上調的蛋白當中,有44個的表達下調,只有8個上調。

這表明乙烯處理后,參與泛素化的基因和蛋白(如E3 ubiquitin-protein ligases)都大量表達,這些泛素化蛋白的表達最終引起其他蛋白產生泛素化,從而導致總體蛋白的大量降解。最后,KEGG分析發現,這些在蛋白和泛素化水平有相反趨勢的蛋白主要參與到黃酮類物質合成、苯丙脂類代謝等通路當中。

6、乙烯通過多個途徑引起花瓣凋謝
最后,綜合轉錄組、蛋白組以及泛素化組的數據,作者詳細地對乙烯引起花瓣凋謝的多條通路進行詳細解釋。乙烯誘導了以下與衰老相關的通路改變:

①轉錄組和蛋白組數據都顯示,乙烯誘導了非泛素依賴降解酶的上升:如半胱氨酸降解酶、絲氨酸降解酶等。

②乙烯促進了與自噬作用相關蛋白的上調:如自噬蛋白PhATG8。

③乙烯處理影響植物激素合成和信號傳導途徑(圖7):乙烯處理后,SAM合成酶(乙烯生物合成的關鍵酶)的泛素化位點大量上升,引起蛋白的數目下降,然而另一個乙烯合成關鍵酶ACO由于去泛素化作用而出現上調。這些證據表明乙烯處理影響生物體內部的乙烯合成與其他激素的合成,如ABA、生長素等。

④最后,作者還發現了乙烯促進蔗糖合成和運輸、阻礙苯環類以及苯丙脂類揮發性物質的合成、減緩氨基酸合成等。這些發現都有助于了解乙烯如何影響花瓣生命周期。


圖6 乙烯影響乙烯生物合成和信號傳導示意圖

文章小結
本文結合轉錄組、蛋白組與泛素化多個組學,在mRNA水平、蛋白水平以及翻譯后修飾水平深入研究花瓣的衰老機制。對大量衰老相關蛋白在衰老過程中泛素化修飾水平和蛋白質水平上的變化進行了重點分析,獲得了大量新的蛋白質泛素化修飾位點,從蛋白質泛素化修飾這一角度對花瓣衰老進行了新的詮釋。

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